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同位素法測(cè)定底物磷酸化活性方法

閱讀次數(shù):1750   發(fā)布時(shí)間:2012/9/27 13:48:11

磷酸化的底物

史葛·艾伯林N庫(kù)馬爾邁克爾J韋伯

微生物學(xué)系和癌癥中心,弗吉尼亞大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng)夏洛茨維爾,弗吉尼亞州22908

摘自蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用第二版

編輯golemis彼得·亞當(dāng)斯·A。

摘要

理想的情況下,人們希望能夠直接磷酸化的基板在一個(gè)完整的細(xì)胞這可能是通過(guò)引入居住或透細(xì)胞三磷酸腺苷的模擬。然而細(xì)胞是不透水的三磷酸腺苷,并增加標(biāo)記的三磷酸腺苷模擬毛地黃皂苷-透細(xì)胞結(jié)果的水解三磷酸腺苷模擬1分鐘內(nèi)喬杜里等人2002。因此,我們選擇了應(yīng)用此技術(shù)的細(xì)胞裂解物或分?jǐn)?shù)。在這里,我們描述的方法直接檢測(cè)基板的蛋白質(zhì)激酶種辦法涉及確定激酶基板immunoprecipitating標(biāo)簽的形式突變激酶轉(zhuǎn)染COS - 1細(xì)胞,并執(zhí)行一個(gè)激酶反應(yīng)增加γ- [標(biāo)記](méi)三磷酸腺苷的模擬第二中方法涉及除重組突變激酶γ- [標(biāo)記](méi)三磷酸腺苷模擬細(xì)胞裂解液。我們使用這些技術(shù)的磷酸化ERK 2基板然而,這種方法可以適用于其他蛋白激酶。

材料方法Ⅰ和Ⅱ,如上)

緩沖器,解決方案,和試劑

重組激酶Ⅱ)

[γ- 32 ]三磷酸腺苷的模擬Ⅰ+Ⅱ)

時(shí)凝膠瓊脂糖

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

激動(dòng)劑例如,表皮生長(zhǎng)因子,血清血小板衍生生長(zhǎng)因子

國(guó)旗平方米瓊脂糖珠

十二烷基硫酸鈉,20%

平方米裂解緩沖液(二(見(jiàn)議定書(shū)1)

公共電視網(wǎng)室溫冰冷的Ⅰ+Ⅱ)(見(jiàn)議定書(shū)1)

無(wú)血清培養(yǎng)基,例如,貝科的介質(zhì))

旗肽(5毫克/毫升的低滲裂解緩沖液

激酶緩沖區(qū)含有脒,10毫米和100毫米氯化鈉(二

2 Laemm li樣品緩沖

低滲裂解緩沖液

20毫米復(fù)7.4

2毫米

2毫米氯化鎂

細(xì)胞的

1細(xì)胞Ⅰ+Ⅱ)

質(zhì)粒

maxi-prep DNA質(zhì)粒攜帶的抗原表位標(biāo)記版本的野生型和突變形式的激酶的興趣

特殊設(shè)備

組織培養(yǎng)皿Ⅰ+Ⅱ)

皮下注射針頭的1 / 41,27計(jì)

提取

透析10000分子量截止Ⅱ)

SDS -聚丙烯酰胺凝膠

旋轉(zhuǎn),設(shè)置在冷藏室(4°丙)

沸水浴,預(yù)設(shè)100°

孵化器,預(yù)設(shè)37°,5%二氧化碳Ⅰ+Ⅱ)

孵化器,預(yù)設(shè)30°Ⅰ+Ⅱ)

離心冷卻到4攝氏°(Ⅰ+Ⅱ)

方法

方法磷酸化激酶底物

重要的是規(guī)范的程序在小型反應(yīng)之前,擴(kuò)大程序識(shí)別新型基板。

1×106100毫米1細(xì)胞組織培養(yǎng)菜的前1天轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)細(xì)胞在37攝氏°5%二氧化碳。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與6µ質(zhì)粒攜帶抗原表位標(biāo)記版本的野生型或突變形式的激酶的興趣,和24µ升的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,根據(jù)制造商的指示。

24至72小時(shí)posttransfection兩次,細(xì)胞與室溫硫化鉛serum-starve他們在無(wú)血清培養(yǎng)基的4 - 12小時(shí)。然后,刺激細(xì)胞激動(dòng)劑5 - 10分鐘。

這取決于激酶正在研究,不同饑餓時(shí)間和興奮劑可以用。

細(xì)胞兩次硫化鉛添加低滲裂解緩沖液(0.5毫升/ 100毫米菜)。

低滲裂解緩沖區(qū)是用來(lái)保護(hù)蛋白相互作用與相關(guān)蛋白。確定相互作用基板,形成穩(wěn)定的協(xié)會(huì),平方米裂解緩沖液(見(jiàn)議定書(shū)1)或另一個(gè)緩沖區(qū)與濃度的增加洗滌劑或鹽可以用來(lái)(哈洛和1999巷

細(xì)胞一起和他們轉(zhuǎn)移到1.5毫升微量管。不要。溶解細(xì)胞的15000g微量離心20分鐘在4°C

轉(zhuǎn)移上清~ 1毫克蛋白新管。保持小等分旁白(20µ克)檢查的表達(dá)水平的蛋白表達(dá)。

時(shí)凝膠適量的瓊脂糖(30µ升/樣本)與低滲緩沖液和混合flag-m2瓊脂糖珠(10µ升/樣本),或珠共軛抗體表位標(biāo)記另一個(gè)選擇~ 1µ克抗體每1毫克的蛋白質(zhì)裂解液)。

混合珠兩次在低滲裂解緩沖液然后將它們添加到裂解制備步驟5(40µ每樣本)免疫。孵化珠在裂解液1 - 2小時(shí)在4攝氏°不斷旋轉(zhuǎn)。

三次免疫沉淀與低滲裂解緩沖液(1毫升每每個(gè)樣品。決賽后的清洗,剩下的幾緩沖使用1個(gè)1 / 4英寸27衡量針。

執(zhí)行激酶反應(yīng)總體積

 

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