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閱讀次數(shù):1750 發(fā)布時(shí)間:2012/9/27 13:48:11
磷酸化的底物
史葛·艾伯林,N維庫(kù)馬爾,和邁克爾J韋伯
微生物學(xué)系和癌癥中心,弗吉尼亞大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng),夏洛茨維爾,弗吉尼亞州22908
摘自蛋白質(zhì):蛋白質(zhì)相互作用,第二版
編輯golemis和彼得·亞當(dāng)斯·A。
摘要
理想的情況下,人們希望能夠直接磷酸化的基板在一個(gè)完整的細(xì)胞。這可能是通過(guò)引入到居住或透細(xì)胞三磷酸腺苷的模擬。然而,細(xì)胞是不透水的三磷酸腺苷,并增加標(biāo)記的三磷酸腺苷模擬毛地黃皂苷-透細(xì)胞結(jié)果的水解三磷酸腺苷的模擬1分鐘內(nèi)(喬杜里等人。2002。因此,我們選擇了應(yīng)用此技術(shù)的細(xì)胞裂解物或分?jǐn)?shù)。在這里,我們描述的方法直接檢測(cè)基板的蛋白質(zhì)激酶。種辦法涉及確定激酶基板immunoprecipitating標(biāo)簽的形式突變激酶轉(zhuǎn)染COS - 1細(xì)胞,并執(zhí)行一個(gè)激酶反應(yīng)增加γ- [標(biāo)記](méi)三磷酸腺苷的模擬。第二中方法涉及除重組突變激酶和γ- [標(biāo)記](méi)三磷酸腺苷模擬細(xì)胞裂解液。我們使用這些技術(shù)的磷酸化ERK 2基板;然而,這種方法可以適用于其他蛋白激酶。
材料(方法Ⅰ和Ⅱ,如上)
緩沖器,解決方案,和試劑
重組激酶(Ⅱ)
[γ- 32 ]三磷酸腺苷的模擬(Ⅰ+Ⅱ)
時(shí)凝膠瓊脂糖珠(我)
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(我)
激動(dòng)劑(我),例如,表皮生長(zhǎng)因子,血清,血小板衍生生長(zhǎng)因子
國(guó)旗平方米瓊脂糖珠(我)
十二烷基硫酸鈉,20%(我)
平方米裂解緩沖液(二)(見(jiàn)議定書(shū)1)
公共電視網(wǎng),室溫(我)和冰冷的(Ⅰ+Ⅱ)(見(jiàn)議定書(shū)1)
無(wú)血清培養(yǎng)基(我,例如,貝科的介質(zhì))
旗肽(5毫克/毫升的低滲裂解緩沖液)(我)
激酶緩沖區(qū)含有脒,10毫米和100毫米氯化鈉(二)
2 Laemm li樣品緩沖(我)
低滲裂解緩沖液(我)
20毫米復(fù)(7.4)
2毫米鈣
2毫米氯化鎂
細(xì)胞的
1細(xì)胞(Ⅰ+Ⅱ)
質(zhì)粒
maxi-prep DNA質(zhì)粒攜帶的抗原表位標(biāo)記版本的野生型和突變形式的激酶的興趣(我)
特殊設(shè)備
組織培養(yǎng)皿(Ⅰ+Ⅱ)
皮下注射針頭的1 / 4,1 ',27計(jì)(我)
提取柱(我)
透析盒,10000分子量截止(Ⅱ)
SDS -聚丙烯酰胺凝膠(我)
旋轉(zhuǎn),設(shè)置在冷藏室(4°丙)(我)
沸水浴,預(yù)設(shè)100°丙(我)
孵化器,預(yù)設(shè)37°℃,5%二氧化碳(Ⅰ+Ⅱ)
孵化器,預(yù)設(shè)30°丙(Ⅰ+Ⅱ)
離心冷卻到4攝氏°(Ⅰ+Ⅱ)
方法
方法:磷酸化激酶底物
重要的是規(guī)范的程序在小型反應(yīng)之前,擴(kuò)大程序識(shí)別新型基板。
1×106到100毫米1細(xì)胞組織培養(yǎng)菜的前1天轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)細(xì)胞在37攝氏°5%二氧化碳。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與6µ克質(zhì)粒攜帶抗原表位標(biāo)記版本的野生型或突變形式的激酶的興趣,和24µ升的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,根據(jù)制造商的指示。
24至72小時(shí)posttransfection洗兩次,細(xì)胞與室溫硫化鉛和serum-starve他們在無(wú)血清培養(yǎng)基的4 - 12小時(shí)。然后,刺激細(xì)胞激動(dòng)劑5 - 10分鐘。
這取決于激酶正在研究,不同饑餓時(shí)間和興奮劑可以用。
洗細(xì)胞兩次冷硫化鉛冰。添加低滲裂解緩沖液(0.5毫升/ 100毫米菜)。
低滲裂解緩沖區(qū)是用來(lái)保護(hù)蛋白相互作用與相關(guān)蛋白。為確定相互作用基板,形成穩(wěn)定的協(xié)會(huì),平方米裂解緩沖液(見(jiàn)議定書(shū)1)或另一個(gè)緩沖區(qū)與濃度的增加洗滌劑或鹽可以用來(lái)(哈洛和1999巷)。
刮的細(xì)胞一起和他們轉(zhuǎn)移到1.5毫升微量管。不要渦。溶解細(xì)胞的15000g在微量離心在20分鐘在4°C
轉(zhuǎn)移上清(~ 1毫克蛋白)為新管。保持小等分旁白(20µ克)檢查的表達(dá)水平的蛋白表達(dá)。
洗時(shí)凝膠適量的瓊脂糖珠(30µ升/樣本)與低滲緩沖液和混合flag-m2瓊脂糖珠(10µ升/樣本),或珠共軛抗體表位標(biāo)記的另一個(gè)選擇(~ 1µ克抗體每1毫克的蛋白質(zhì)裂解液)。
洗混合珠兩次在低滲裂解緩沖液,然后將它們添加到裂解制備步驟5(40µ我每樣本)免疫。孵化珠在裂解液1 - 2小時(shí)在4攝氏°不斷旋轉(zhuǎn)。
洗三次免疫沉淀與低滲裂解緩沖液(1毫升每洗每個(gè)樣品)。決賽后的清洗,吸剩下的幾滴緩沖使用1個(gè)1 / 4英寸,27衡量針。
執(zhí)行激酶反應(yīng)總體積
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