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閱讀次數(shù):2280 發(fā)布時間:2012/9/14 8:45:22
Standard Number | Dilution Factor | Dilutions | Value |
Standard 1 | Pool | 360μl Standard 1 | 25600 |
Standard 2 | 1:4 | 90μl Stnd. 1 + 270μl H2O | 6400 |
Standard 3 | 1:16 | 90μl Stnd. 2 + 270μl H2O | 1600 |
Standard 4 | 1:64 | 90μl Stnd. 3 + 270μl H2O | 400 |
Standard 5 | 1:256 | 90μl Stnd. 4 + 270μl H2O | 100 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | High St. 1 | St. 2 | St. 3 | St. 4 | Low St. 5 | No cDNA | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
Gene 1 B | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | |
C | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | |
D | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | |
E | High St. 1 | St. 2 | St. 3 | St. 4 | Low St. 5 | No cDNA | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
Gene 2 F | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | |
G | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | |
H | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | High St. 1 | St. 2 | St. 3 | St. 4 | Low St. 5 | No cDNA | 1 | 2 | 3 | 4 | | | |
β2M B | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | | | |
C | | | | | | | | | | | | | |
D | | | | | | | | | | | | | |
E | High St. 1 | St. 2 | St. 3 | St. 4 | Low St. 5 | No cDNA | 1 | 2 | 3 | 4 | | | |
Gene X F | " | " | " | " | " | " | " | " | " | " | | | |
G | | | | | | | | | | | | | |
H | | | | | | | | | | | | |
Sample | β2M | Gene X |
1 | 14000 | 8800 |
2 | 13800 | 9300 |
3 | 12200 | 13700 |
4 | 12400 | 13500 |
Sample | β2M | Gene X | Gene X/β2M |
1 | 14000 | 8800 | .629 |
2 | 13800 | 9300 | .674 |
3 | 12200 | 13700 | 1.123 |
4 | 12400 | 13500 | 1.089 |
Sample | β2M | Gene X | Gene X/β2M | Normalization | Induction |
1 | 14000 | 8800 | .629 | 0.965 | 1 |
2 | 13800 | 9300 | .674 | 1.035 | |
3 | 12200 | 13700 | 1.123 | 1.724 | 1.698 |
4 | 12400 | 13500 | 1.089 | 1.672 | |
總結(jié)
定量聚合酶鏈反應(yīng)是一種用來檢測相對或絕對的基因表達(dá)水平。所有涉及使用熒光定量PCR檢測閾值循環(huán)(電腦斷層)在反應(yīng)時的水平,熒光信號的背景,給出了在線性部分的放大曲線。這個值是負(fù)責(zé)準(zhǔn)確量化定量PCR。
綠色熒光是一種染料,也是與雙鏈脫氧核糖核酸。插導(dǎo)致熒光的熒光。該定量PCR檢測熒光和軟件計算值從熒光強(qiáng)度。
這個協(xié)議將包括綠色熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù),包括建議,工具使用和概述了如何分析你的數(shù)據(jù)。
制備
定量聚合酶鏈反應(yīng)*初制定檢測拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)錄表達(dá),基本上就是我們還是當(dāng)我們進(jìn)行定量PCR。
1。),核糖核酸是孤立從樣品。使用的技術(shù)隔離核糖核酸,*適合你。提取的方法工作,并有許多好的工具包,它提供。
推薦:孤立的細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠肝,我使用的試劑試劑盒試劑盒(貓。74104號)
這包將在許多組織和細(xì)胞類型。主動脈,我使用的試劑試劑盒纖維組織迷你包(貓。74704號)
2)。為了保存樣品,這是非常容易降解在室溫下,我建議使用一個鏈合成的核糖核酸聚合酶鏈反應(yīng)制備,而RT - PCR同時運行。
建議:為鏈脫氧核糖核酸合成,使用我公司的標(biāo)三鏈合成系統(tǒng)的RT - PCR(貓。第18080-051)
這將創(chuàng)建在一個1 : 1的比例,在您的樣品。
3。)的定量PCR本身,你將需要你的基因樣本,從樣本的標(biāo)準(zhǔn),具體的引物的基因的興趣,和熒光綠色混合(其中包括綠色熒光染料,耐熱聚合酶,火箭,和核苷酸都在一個)。
建議:綠色熒光試劑盒可從許多公司。我建議試劑盒的quantitect綠色熒光聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(貓。204143號的500 rxns,貓。204145號的2500 rxns)
你還需要一個內(nèi)部控制點的比較數(shù)據(jù)。選擇管家基因,是內(nèi)源性表達(dá)的細(xì)胞類型(例如β- 2微球蛋白,β-肌動蛋白)。
4。)*后,前板,確保注冊使用定量聚合酶鏈反應(yīng)機(jī)提前時間。2可用選項:
1。您可以使用注冊一個在基因型芯第五樓所有的x72461。成本是40美元,而你需要登錄時提交板。
2。或者你可以使用一個在史提夫博士的實驗室。網(wǎng)上報名在http://calendar.yahoo.com登錄“younglabqpcr“密碼”7500abi”。
制定標(biāo)準(zhǔn)
每一個基因上運行的定量PCR將需要運行一個標(biāo)準(zhǔn)曲線,相對定量值的樣品。
以下協(xié)議假定您已創(chuàng)建的核糖核酸基因PCR之前。如果你遵循公司上標(biāo)三包的協(xié)議,你應(yīng)該開始與21μ我每樣基因。
1。)每個基因樣本~ 4倍稀釋。在這種情況下,稀21μ升59升的水μ*后一卷80μL渦和自旋向下。
2。)池同等數(shù)量從每個樣品到一個單一的管。這將是標(biāo)準(zhǔn)的1,你的高標(biāo)準(zhǔn)。確定有多少拉從每個樣品,計算出多少錢,你會把每個樣品和*終體積的標(biāo)準(zhǔn)將。(這是有大致相同的*終體積的標(biāo)準(zhǔn)和樣品。)
Ø例子。)
30μ從每個樣品和12池標(biāo)準(zhǔn)1的*后一卷360μL
*終樣本量將樣品數(shù)量* 5后,5倍稀釋(見下)。在這種情況下,(80 - 30μμ長)* 5 = 250μ我每個樣品,*后一卷。
90μ信用標(biāo)準(zhǔn)1在一個新的管標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)2。稀釋標(biāo)準(zhǔn)2與270μ升的水的*后一卷360μ屬重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)5。
*后的標(biāo)準(zhǔn)量將*初的標(biāo)準(zhǔn)量- 90μ我之后的下一個標(biāo)準(zhǔn)。在這種情況下,360μ標(biāo)準(zhǔn)1 - 90μ= 270μ信用標(biāo)準(zhǔn),*后一卷。
3)創(chuàng)建。其余的標(biāo)準(zhǔn)采取了1 /第四的*后標(biāo)準(zhǔn)和稀釋4倍。每個標(biāo)準(zhǔn)都有一個值分配給它的,如下。
例子。)
標(biāo)準(zhǔn)編號稀釋因子稀釋值
標(biāo)準(zhǔn)1池360μ標(biāo)準(zhǔn)1
25600
標(biāo)準(zhǔn)2
4
90μ我加戒備。1 + 270μ我水
6400
標(biāo)準(zhǔn)3
16
90μ我加戒備。2 + 270μ我水
1600
標(biāo)準(zhǔn)4
64
90μ我加戒備。3 + 270μ我水
400
標(biāo)準(zhǔn)5
256
90μ我加戒備。4 + 270μ我水
100
4。)記得渦和自旋下來后,每個稀釋步驟!
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