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如何成為細(xì)胞培養(yǎng)大神?

閱讀次數(shù):969   發(fā)布時(shí)間:2018/9/17 11:24:27

     問世間誰人無憂,唯神仙逍遙自在。作為一名終日泡在實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)君,如何在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中無所不能,超脫輪回做到一個(gè)人人羨慕的細(xì)胞大神呢?且看向這里,成為細(xì)胞大神的六個(gè)細(xì)節(jié)。
1. 過濾體系
    自從出現(xiàn)瓶裝培養(yǎng)基之后,培養(yǎng)基過濾的需求就減少了。有些時(shí)候,一些特定細(xì)胞培養(yǎng)支持物的添加可能會引入一些新的污染。另外,一般認(rèn)為,當(dāng)液體長時(shí)間接觸瓶口外的空氣后重新過濾;所以一般不建議 管/瓶 對 管/瓶 的傾倒。這時(shí),很多人會選擇Millipore的濾嘴配合針筒進(jìn)行再過濾。結(jié)果發(fā)現(xiàn),完成500 ml培養(yǎng)基過濾后,手疼腰酸!過濾杯的出現(xiàn)完美的解決了這個(gè)問題,所以,大體積盡量使用過濾杯吧,可靠且輕松,快捷。
2. 培養(yǎng)基的選擇
    關(guān)于血清質(zhì)量,業(yè)界流行的澳洲來源 > 北美來源 >南美來源的說法。這一點(diǎn)從價(jià)格上也可見一斑。實(shí)際情況是優(yōu)質(zhì)血清的市場現(xiàn)實(shí)是供不應(yīng)求,所以很多時(shí)候大家就將就了之。如果有好的選擇,盡量使用澳洲來源的血清。
   對于培養(yǎng)基而言,情況顯然是供大于求的,而且品牌甚多:Sigma,Gibco,Hyclone以及各種國產(chǎn)培養(yǎng)基等,當(dāng)然一些國外廠商基于競爭及成本的考慮也推出了本土化的培養(yǎng)基。一些人認(rèn)為培養(yǎng)基能用就行,反正細(xì)胞就在那里長著,也沒出現(xiàn)大規(guī)模的傷亡就忽視了培養(yǎng)基的重要性。但是,實(shí)驗(yàn)是對完美的追求,多處將就會導(dǎo)致結(jié)果的將就,得不償失!從細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)際表現(xiàn)(活力,增殖周期,狀態(tài)等)看,原裝進(jìn)口培養(yǎng)基 > 進(jìn)口分裝培養(yǎng)基 > 大部分國產(chǎn)培養(yǎng)基。所以,別再將就培養(yǎng)基了!
    如果是因?yàn)閮r(jià)格原因而放棄原裝進(jìn)口培養(yǎng)基,現(xiàn)在好的機(jī)會來了。Merck/Sigma推出原裝進(jìn)口培養(yǎng)基國產(chǎn)價(jià)格,覆蓋幾乎全部基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
3. 支原體檢測
   支原體污染和細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)會形影不離,堪稱細(xì)胞培養(yǎng)的惡夢。前些年有報(bào)道說全球超過60%的實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞存在細(xì)胞污染的現(xiàn)象。從早期表現(xiàn)看,支原體污染會讓你感覺不到,可能僅僅是細(xì)胞增速有些減緩;于是還是快樂的做的實(shí)驗(yàn),結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不是很理想。事實(shí)是,支原體污染會影響細(xì)胞代謝,改變細(xì)胞功能等。
   藥典檢測支原體是培養(yǎng)法,時(shí)間以周記,這顯然不符合科研”快”的需求。PCR法應(yīng)運(yùn)而生,Sigma的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit,擴(kuò)增的是支原體基因組上16S核糖體RNA基因。此區(qū)域高度保守,因此可檢測多達(dá)19種支原體。但是PCR后的電泳也是一件麻煩的事情。
4. 胰酶的使用
   胰酶適合大部多數(shù)細(xì)胞的消化:HEK293,CHO,HeLa等,而這類細(xì)胞我們往往將他定義為“糙”。當(dāng)然,細(xì)胞本身肯定是不糙的,同樣相當(dāng)金貴。只不過這些細(xì)胞對胰酶的耐受性好,一定濃度下的胰酶對細(xì)胞狀態(tài)影響不大。
   有些細(xì)胞就非常金貴了,堪稱“嬌嫩”,比如:干細(xì)胞/">干細(xì)胞等,就不太適合利用胰酶進(jìn)行消化。另外,如果消化組織進(jìn)而分離細(xì)胞時(shí)使用胰酶也是值得小心的。一個(gè)好的解決方案是尋找一些溫和的替代品:Accutase、Accumax或EZ-LIFT。這些消化劑劑的特點(diǎn)是可替代胰酶,消化后無需用血清失活。尤其是EZ-LiFT™干細(xì)胞/">干細(xì)胞傳代試劑,這是一種無酶、化學(xué)成分限定的干細(xì)胞解離試劑,只選擇性傳代未分化的多能干細(xì)胞,避免人工進(jìn)行群落篩選或細(xì)胞刮鏟的步驟,不需要使用ROCK抑制劑即可產(chǎn)生高細(xì)胞活性,還可以拯救高度分化的ips細(xì)胞培養(yǎng)物。
5. 細(xì)胞計(jì)數(shù)
   細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)的日常。血球計(jì)數(shù)器、載破片、蓋玻片的組合折磨的每一個(gè)技術(shù)者的眼睛及耐心。所幸的是,一些公司根據(jù)血球計(jì)數(shù)的原理開發(fā)出了自動的計(jì)數(shù)儀,插入裝有細(xì)胞的蓋玻片即可。事實(shí)上,基于血球計(jì)數(shù)原理的另外一個(gè)問題是計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。一般認(rèn)為CV可能在20%以上,這就非常糟糕了,打算加入10000個(gè)細(xì)胞,很可能計(jì)入了15000個(gè)細(xì)胞,這是絕對不能接受的。
   另外一個(gè)計(jì)數(shù)方法是基于庫爾特原理---類似與流式的方法,將細(xì)胞挨個(gè)數(shù)一遍?吹竭@個(gè),可能想得是:這么大的一起,這么麻煩怎么做日常計(jì)數(shù)?Merck的做法是將這個(gè)設(shè)備小型化了:Sceptor,整體和一把1 ml移液槍類似。15秒內(nèi)完成細(xì)胞技術(shù)且CV小于5%。
6. 細(xì)胞凍存
   細(xì)胞傳代過程中涉及細(xì)胞凍存。這么說其實(shí)是很有歧義的,嚴(yán)格意義上說獲得細(xì)胞系完成檢測后件事就是大批量凍存細(xì)胞,而后開始進(jìn)行該細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。常規(guī)來說,一株細(xì)胞的使用周期不宜過長,這樣能排除反復(fù)傳代過程中細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。所以,很多時(shí)候他人惠贈的細(xì)胞系可能會存在傳代過多的問題,一個(gè)好的方案是從ATCC或ECACC(歐洲細(xì)胞庫)購買細(xì)胞,這些平臺的細(xì)胞背景干凈,傳代次數(shù)少。
   DMSO是*常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑,市面上品牌眾多,質(zhì)量參差不齊。如果使用劣質(zhì)DMSO凍存細(xì)胞,可能從實(shí)驗(yàn)的步開始就已經(jīng)出了細(xì)胞品質(zhì)不好的問題。推薦使用Sigma的DMSO,較多細(xì)胞凍存驗(yàn)證的;或者直接使用其DMSO無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基,確保細(xì)胞贏在起跑線。
  上海恒遠(yuǎn)致力于提供生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)服務(wù),提供全方位實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù),為廣大科研工作者大大節(jié)省了重復(fù)勞動的時(shí)間和精力,我們有過硬的技術(shù)咨詢和完善的售后服務(wù),為您解決后顧之憂。
 

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