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ELISA試劑盒測(cè)定技術(shù)的發(fā)展

閱讀次數(shù)：961 發(fā)布時(shí)間：2016/8/3 9:40:22

Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。然而，影響Elisa試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。
elisa試劑盒測(cè)定技術(shù)的發(fā)展
臨床測(cè)定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展，而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。目前，分子生物學(xué)正在并*終肯定會(huì)讓我們對(duì)整個(gè)生命科學(xué)有一個(gè)全面而徹底的認(rèn)識(shí)，其對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，它使我們對(duì)以前一些難以檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的測(cè)定變得輕而易舉，并且大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。
1、基因工程試劑對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響

免疫測(cè)定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開(kāi)優(yōu)質(zhì)的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過(guò)各總化學(xué)合成方法制備。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測(cè)定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測(cè)定方法也不斷出現(xiàn)。

HBsAg試劑特點(diǎn)（檢測(cè)模式：臨床抗體夾心法）：

　　包被抗體為山羊多抗，多抗具有高親和性和對(duì)抗原各種表位的反應(yīng)性。

　　酶表抗體為與HBsAg有不同結(jié)合位點(diǎn)的鼠復(fù)合單位。

　　可測(cè)得HBsAg變異樣品。

　　提高檢測(cè)的特異性（99.98%）

　　提高檢測(cè)的靈敏度，應(yīng)用ParlEhrich學(xué)說(shuō)（PEI）HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)ad標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為0.05nｇ/ml對(duì)ay標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為0.025ng/ml

　　2、基因工程

　　較早用于免疫測(cè)定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,這兩種基因工程抗原的出現(xiàn)，較好地解決了抗HBc和HBe的測(cè)定問(wèn)題。因?yàn)橐獜牟《颈旧砣ゴ罅揩@取這兩種純抗原較為困難，并且這一點(diǎn)對(duì)于難培養(yǎng)的病原微生物來(lái)說(shuō)，如HIV、HCV和梅毒螺旋體等都有些共性。

　　2.1HCV-Elisa試劑

　　HCV目前尚不能體外培養(yǎng)，只能用基因工程或化學(xué)合成方法獲取HCV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的各種抗原片斷，已知HCV基因組有7個(gè)功能區(qū)組成：核心、E1、E2/NS1NS2NS3NS4NS5（有分為NS5a和NS5b）區(qū)，合成抗原的優(yōu)點(diǎn)是易于純化，特異性好，抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)。

　　2.1.1代抗HCV-ELISA試劑盒：

　　-由美國(guó)ortho公司克隆C1003抗原幾個(gè)片斷與人超氧化物歧化酶（SOD）結(jié)合。用酵母從病毒基因組非結(jié)合區(qū)得到表達(dá)，表達(dá)為融合蛋白，亦作為包被固相載體。

　　-抗原組合：NS4區(qū)二個(gè)基因片斷為NS5-1-1和C1003

　　-特性：IgG抗C100在發(fā)病后數(shù)月后，才檢出，故不宜作早期診斷。

　　-約由20%的病人不出現(xiàn)抗體。IgM抗-C100急性期檢出率只有64%。

　　-C100的抗原性較弱，在HCV復(fù)制中，不能充分暴露宿主的免疫系統(tǒng)。

　　-特異性和靈敏性較差。

　　2.1.2第二代HCV-ELISA試劑盒

　　-用基因重組的HCV結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白抗原包被固相載體。

　　-抗原組合：核心區(qū)（C區(qū)）多肽C22NS區(qū)多肽C33C1003和NS5-1-1

　　-增加C22區(qū)和C33區(qū)后，抗體出現(xiàn)早，有助早期診斷，提高陽(yáng)性率。有利早期診斷。

　　-C22是早期易出現(xiàn)病毒血癥

　　2.1.3第三代HCV-ELISA試劑盒

　　人工合成多肽抗原，由36個(gè)氨基酸組成的Cp9（內(nèi)殼蛋白）和19個(gè)氨基酸組成Cp10混合包被固相載體。

　　抗原組合：除有C100-3C22C33外又增加了core和NS3NS4NS5

　　特點(diǎn)：

　　*coreNS3NS5由Baculovirus重組表達(dá)，沒(méi)有非特異性的載體，試劑特異性高，重組的蛋白經(jīng)融合形成大分子抗原，利于提高檢測(cè)靈敏度。

　　*NS3區(qū)增加了氨基酸片斷（比例十分重要）。改進(jìn)了反映的靈敏度。

　　*NS5經(jīng)優(yōu)化，徐去了非特異性的區(qū)域（G-D-D）NS3NS5是血轉(zhuǎn)化*早測(cè)得的抗體，提高了診斷的準(zhǔn)確性。

　　*NS4為倆個(gè)片斷的合成多肽，去掉了非特異性反應(yīng)的區(qū)域，加強(qiáng)了試劑的靈敏度和特異性。

　　2.1.4第四代HCV—ELISA試劑盒

　　-美國(guó)新近推出一種包括HCV基因組7個(gè)功能區(qū)所有免疫決定基的單一融合蛋白，稱為多決定基融合抗原，采用表面活性劑處理分界病毒表面復(fù)合物，釋放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，靈敏度可達(dá)500拷貝/ml，已接近核酸擴(kuò)增檢測(cè)水平。

　　-抗原組合：以Core和NS3作為主要檢測(cè)片斷（比例十分重要）加合成多肽NS4

　　-特點(diǎn)：直接測(cè)Core抗原

　　不易發(fā)生變異

　　抗IgM和IgG檢出率可達(dá)100%

　　特異性達(dá)99.8%靈敏度為100%

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